Không lâu sau khi Mary thành hôn Darnley, bà nhận thấy được sự phù phiếm, kiêu ngạo và không đáng tin của ông, có thể ảnh hưởng đến an ninh của đất nước. Giới quý tộc không có cảm tình tốt với Henry và ông lại có những hành động mang tính bạo lực, hậu quả của việc uống nhiều rượu.[1] Mary từ chối công nhận Darnley là vua qua hôn nhân, thứ mà ông cần để bước lên ngôi báu nếu nữ hoàng chết mà không có con.[24] Tháng 5 năm 1565, chưa đầy một tháng sau khi kết hôn, William Cecil nghe tin rằng Darnley đã hành động xấc xược khi đẩy Lennox khỏi triều đình Scotland. Mary sớm mang thai.

Thư ký riêng của Nữ hoàng, David Rizzio bị đâm 56 nhát vào ngày 9 tháng 3 năm 1566 bởi Lord Darnley và những người bạn của ông ngay trước mặt Nữ hoàng-vốn đang mang thai tháng thứ 7-trong phòng ăn của bà. Theo nhà ngoại giao người Anh Thomas Randolph và Bá tước Bedford, việc giết chết Rizzio (người được đồn đại là cha thực sự của đứa con trong bụng Mary) là một phần trong kế hoạch Darnley nhằm buộc Mary phải phong cho mình là Đồng cai trị. Darnley cũng bàn với các đồng minh, yêu cầu họ tiến cử mình là Đồng cai trị trước Nghị viện Scotland để đổi họ sự khôi phục các lãnh địa và chức danh của họ.[25]

Khi đại sứ Tây Ban Nha ở Paris nghe được tin này, tin đồn rộ lên rằng Henry đã "giết vợ mình, thừa nhận những người dị giáo xứ, và chiếm giữ toàn bộ vương quốc." Tuy nhiên, vào ngày 20 tháng 3, Darnley tuyên bố phủ nhận mọi sự liên can hay đồng lõa trong vụ giết Rizzio.

Mary không còn tin tưởng chồng và Darnley bị thất sủng. Ngày 27 tháng 3, Bá tước Morton và Huân tước Ruthven (đều có mặt trong vụ giết Rizzio và đã bỏ trốn sang nước Anh), đã viết thư cho Cecil nói rằng Darnley đã khởi xướng các âm mưu giết người và thu dùng họ, vì "heich cãi nhau" và "hận thù chết người" của Rizzio.[26]